11 – Resposta de células-tronco de diferentes origens a biocerâmica de fosfato de cálcio bifásico

Celular e Tecidual Research2015361 : 2116

DOI: 10,1007 / s00441-015-2116-9

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Regular artigo

– Revista:

Celular e Tecidual Research

Agosto 2015, Volume 361, Issue 2, pp 477-495,

Acesso livre

Data: 13 fevereiro de 2015

Genética Humana 

Início> Ciências Biomédicas> Genética Humana

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Autores: 

Sonja E. Lobo ^{1, 2, 5, 7}   , Robert Glickman ³   , N. Wagner da Silva ⁴   , Treena L. Arinzeh ⁵   e Irina Kerkis ^{1, 6}  

(1) Departamento de Morfologia e Genética da Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brasil

(2) Departamento de Biomaterials & Biomimetics, Faculdade de Odontologia, Universidade de Nova Iorque, New York, NY, EUA

(3) Departamento de Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial da Faculdade de Odontologia da Universidade de Nova York, New York, NY, EUA

(4) Departamento de Cirurgia Ortopédica Prof. Matta Machado, Hospital da Baleia, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil

(5) Departamento de Engenharia Biomédica, New Jersey Institute of Technology, Newark, NJ, EUA

(6) Departamento de Genética do Instituto Butantan, na Avenida Vital Brasil, 1500, São Paulo, Brasil, 05503-900

(7) Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, Avenida Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva, 87, São Paulo, Brasil, 05508-270

Sonja E. Lobo  (Autor correspondente)
Email: sonja.e.lobo@gmail.com

Robert Glickman
Email: rsg1@nyu.edu

Wagner N. da Silva
Email: wagner_nogueira@hotmail.com

Treena L. Arinzeh
Email: arinzeh@njit.edu

Irina Kerkis  (Autor correspondente)
Email: ikerkis@butantan.gov.br

Recebido: 23 de maio de 2014Aceito: 05 de janeiro de 2015Publicado on-line: 13 de fevereiro de 2015© O autor (s) 2015

Resumo

Fosfato de cálcio bifásico (BCP) biocerâmica ter sido aplicado com sucesso numa vasta variedade de formas de apresentação e com diferentes proporções de hidroxiapatite (HA) e fosfato tricálcico-β (β-TCP). BCPs foram carregados com células-tronco de diferentes origens para fins de engenharia de tecido ósseo, mas a evidência do comportamento de células-tronco em diferentes composições (índices diferentes de HA / β-TCP) e características físicas de BCPs é limitado. Nós comparamos a adesão, proliferação, viabilidade e potencial osteogênico das células-tronco mesenquimais humanas (CTMs) no BCPs granulares com igual proporção / β-TCP HA de diversos tamanhos de partículas e em blocos porosos que tinham diferentes composições químicas. Além disso, a diferenciação das MSCs osteogénica foi comparado com derivados de tecido adiposo (ADSC) e polpa dentária (DPSC) células estaminais, bem como de pré-osteoblastos sobre um BCP em partículas. MSCs que crescem em BCPs granulares demonstrou aumento do número em comparação com MSCs que crescem em blocos. As células proliferaram em maior medida nas pequenas BCPs granulares, enquanto as grandes BCPs granulares e blocos promoveu diferenciação celular.Surpreendentemente, a expressão de genes envolvidos na osteogénese foi regulada positivamente em MSCs em biocerâmica em meio basal, que indica que pode ter potencial BCPs osteoindutora. Isto foi confirmado com a regulação positiva de marcadores osteochondrogenic, em diferentes pontos no tempo, quando as células estaminais a partir de vários tecidos foram cultivadas em BCP. Este estudo demonstra que BCPs, dependendo de suas características físicas e composição química, modular o comportamento de células-tronco, e que as células-tronco de diferentes origens são inerentemente distinta em seu perfil de expressão gênica e pode ser acionado em direção destino osteochondrogenic por BCPs.

Palavras-chave

Hidroxiapatita β-tricálcio fosfato células-tronco mesenquimais células-tronco adiposas derivadas de células-tronco da polpa dentária

Abreviações

ADSC: Células-tronco derivadas de tecido adiposo

ALP: A fosfatase alcalina

BCP: Biocerâmicas de fosfato de cálcio bifásicos

BSP:  Sialoproteína óssea

β-TCP: Fosfato tricálcico

BetaC: Controlo (basal)

médioIC: Intervalo de confiança

DPSC: Células-tronco da polpa dentária

HA: Hidroxiapatita

MSC: Células-tronco mesenquimais

OPN: Osteopontin

OS: Médio osteoindutivo

TCP: Placa de cultura de tecido

Introdução

Reconstrução bem sucedida de defeitos ósseos críticos requer enxertos ósseos ou materiais de enxerto capazes de restaurar a função através da promoção de novo crescimento ósseo e apoio biomecânico adequada. Biocerâmicas de fosfato de cálcio bifásico (BCP) têm sido considerados substitutos ósseos óptimas devido à sua segurança, osteocondutividade, bioatividade, biocompatibilidade, disponibilidade ilimitada comprovada e seu uso potencial como um andaime para sistemas de distribuição de engenharia de tecidos e drogas (Ohgushi e Caplan 1999 ; Le Nihouannen et al., 2007 ; Saldaña et al. 2009 ; Cheng et al.2010 ; Lobo e Livingston Arinzeh 2010 ; Schumacher et al. 2010 ; Wang et al. 2010 ;. Yuan et ai 2010 ).Andaimes BCP, composto por diferentes proporções de hidroxiapatite (HA) e fosfato tricálcico-β (β-TCP), pode ter uma variedade de topografias de superfície, os tamanhos dos poros e porosidade (Arinzeh et ai.2005 ;. Mastrogiacomo et ai 2006 ; felá et al. 2010 ) e tem sido amplamente utilizado em várias formas, tais como grânulos ou partículas, blocos, cimentos e implantes feitos por medida. Estes biomateriais também pode ser fabricado como compósitos com materiais naturais e poliméricos, preenchendo assim uma ampla gama de exigências clínicas que incluem não-carga e locais de suporte de carga, bem como a reconstrução de grandes defeitos ósseos (Ohgushi e Caplan 1999 ; Livingston et al . 2003 ; Marcacci et al., 2007 ; Matsushima et ai. 2009 ; Saldaña et al. 2009 ; Schumacher et ai. 2010 ;. Teixeira et al 2010 ; Weir e Xu2010 ; Garrido et al., 2011 ; Fig.  1 ).

Biomateriais com diferentes formas de apresentação ter aplicações clínicas distintas. Por exemplo, grânulos e cimentos são normalmente utilizadas para preencher cavidades ósseas que resultam de quistos ósseos e os tumores; grânulos são também utilizados para recuperação de áreas onde a necessidade de formação óssea mais rápida ultrapassa a exigência de uma maior estabilidade e resistência mecânica.Alternativamente, blocos, dispositivos de pré-forma (como cunhas e gaiolas) e implantes feitos sob medida (projetados especificamente para cada paciente) são geralmente para locais sujeitos a altas cargas e para a reconstrução anatômica estética e precisa imediatamente após o procedimento cirúrgico (de Oliveira et al.2007 ; Garrido et al. 2011 ).

A diversidade da resposta do tecido e propriedades mecânicas obtidas em andaimes BCP são uma consequência das suas estruturas químicas e físicas. Alguns BCPs foram classificados como osteoindutor, devido à sua capacidade para modificar a expressão de genes de células osteogénicas e osteossarcoma humano e para induzir a formação de osso heterotopicamente, em modelos in vivo, sem a adição de moléculas bioactivas, tais como BMP (proteína morfogenética óssea), principalmente em grandes modelos animais (Rochet et al., 2003 ; Yuan et al. 2010 ;. Barradas et ai 2011 ). Estudos recentes têm lançar luz sobre mecanismos moleculares que explicam esta propriedade osteoindução intrínseca que tem sido atribuída principalmente à composição química e características físicas, tais como a topografia da superfície e tamanho e forma de poros do biomaterial (Ripamonti 1996 ; LeGeros 2008 ; Cheng et al . 2010 ; Yuan et al. 2010 ; Barradas et al. 2011 ; Shih et al. 2014 ;. Xia et al 2014 ).

Nanoestruturados BCPs, composto por 65% de HA / 35% ß-TCP (Osteosynt®; EINCO Biomaterial, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil), que têm interconexão micro e macroporos (diâmetros <10 e> 100 mm, respectivamente) (LeGeros et al. 2003 ; Lobo e Livingston Arinzeh 2010 ) e várias formas, têm sido usadas com sucesso em aplicações ortopédicas e craniofaciais (de Oliveira et al. 2007 ;. Garrido et al 2011 ; Fig.  1). No entanto, o seu potencial para serem utilizados como andaimes em combinação com as células estaminais para a engenharia de tecidos não foi investigada. Além disso, estudos clínicos anteriores mostraram que a reconstrução de defeitos ósseos segmentais que excedem 3 cm de comprimento em ossos longos, utilizando os materiais obtidos podem requerer mais do que um procedimento cirúrgico ou de um longo período de tempo para curar (al. Garrido et 2011 ). Assim, estratégias terapêuticas alternativas são necessárias para reconstruir estes defeitos desafiantes. A combinação de células estaminais com BCPs pode ser uma abordagem viável.

Por outro lado, para as aplicações de engenharia de tecido ósseo, as células estaminais isoladas a partir de tecidos diferentes tem sido associada a uma grande variedade de biomateriais, incluindo biocerâmica, a fim de aumentar a formação de tecido ósseo (Laranjeira et ai. 2013 ;. Temple et ai 2014 ). Células-tronco mesenquimais isoladas da medula óssea (MSCs), células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSC) e as células-tronco da polpa dentária (DPSC) são os tipos de células-tronco adultas mais comumente estudadas e caracterizadas (Shi et al. 2001 ; Rosenbaum et al. 2008 ; Huang et al. 2009 ; Gronthos 2011 ;. Utsunomiya et al 2011 ; Kerkis e Caplan 2012 ; Harasymiak-Krzyzanowska et al. 2013 ). No entanto, a literatura é escassa em dados que compara a resposta de diferentes tipos de células estaminais cultivadas na mesma biomaterial.

Este estudo foi realizado com base nas hipóteses de que: (1) apresentam biocerâmica composição química distinta e características físicas provocam a resposta de células-tronco e diferencial pode ser osteoindutor, e que (2) as células estaminais isoladas a partir de vários tecidos de um comportamento diferente quando semeado no mesmo tipo de andaime. Esta investigação teve como objetivo analisar o potencial de biocerâmica, que têm sido aplicados com sucesso em cirurgias ortopédicas e craniofaciais (de Oliveira et al.2007 ;. Garrido et al 2011 ), para funcionar como transportadores de células-tronco e para induzir sua diferenciação osteogênica, bem como comparar o potencial de biocerâmica que apresentam a mesma composição química e estrutura física para acionar destino osteogênico das células-tronco adultas de diferentes origens. Portanto, a proliferação, viabilidade e diferenciação osteogênica de MSCs cultivadas em seis andaimes BCP diferentes, divididos em dois grupos, grânulos (G20-40, G40-60 e G60-80) e blocos porosos (BCP1, BCP2 e BCP3), foram avaliados . Os grânulos tinham o mesmo rácio de HA / TCP variada mas em estrutura física, isto é, o tamanho dos grânulos. Os blocos diferiam na composição. A proliferação celular e a viabilidade foram medidos utilizando dois ensaios diferentes, o conteúdo de DNA e actividade metabólica, ao longo do tempo. A diferenciação osteogénica foi avaliado por expressão de genes e a actividade da fosfatase alcalina ao longo do tempo. Além disso, a determinação do destino da célula osteogénica de MSC, ADSC e DPSC em uma forma granular de BCP (G20-40) foi comparado ao pré-osteoblastos. A adesão celular foi analisada através de microscopia electrónica de varrimento e a expressão de genes responsáveis ​​pela determinação do destino das células estaminais foi investigada por RT-PCR.

Materiais e métodos

Materiais

Nanoestruturada micro e macroporosos de fosfato de cálcio bifásico (BCP) biocerâmica baseados foram fornecidos por EINCO biomaterial sob a forma de grânulos e blocos. Os grânulos tinham diferentes tamanhos de partículas e foram irregulares em forma, mas tinham a mesma composição química: 65/35 (% em peso /% em peso) HA / SS-TCP. Eles foram designados: G20-40 (correspondente a grânulos de 20-40 mesh, com maior diâmetro de até 1,5 mm); G40-60 (grânulos de malha de 40-60, em que o maior diâmetro correspondeu a 1 mm); e G60-80 (correspondendo a partículas de 60-80 de malha, que tinha uma média de 0,7 mm na maior diâmetro). Os blocos, 5 mm de diâmetro e 2 mm de espessura, tinha diferentes composições químicas: BCP1 foi composto por 65/35% de HA / SS-TCP, ou seja, a mesma composição dos grânulos, BCP2 foi um composto de HA e poli ( 2-metil methylpropenoate), e BCP3 foi composta de relação / β-TCP 10% / 90% de HA (Tabela  1 ). A composição química foi verificada por meio de DRX (dados não mostrados).As topografias de superfície foram avaliados qualitativamente por microscopia eletrônica (SEM) de visualização da superfície dos andaimes digitalização. Para a análise comparativa de diferenciação osteogênica de células-tronco a partir de origens distintas, foram utilizados os grânulos G20-40.

Tabela 1

Composição química, forma física e porosidade dos seis andaimes BCP diferentes

Amostras	Composição química (rácio / β-TCP HA)	Forma física	Porosidade
Micro	Macro
Bioceramics	G20-40	65% / 35%	Grânulos	***	***
G40-60	65% / 35%	Grânulos	***	**
G60-80	65% / 35%	Grânulos	***	*
BCP1	65% / 35%	Blocos	***	**
BCP2	100% de HA / polímero	Blocos	***	***
BCP3	10% / 90%	Blocos	***	**

O SBDC foram grânulos (G20-40, G40-60 e G60-80) e blocos (BCP1, BCP2 e BCP3). Os grânulos tinham o mesmo volume de microporos (<10 um) mas diferentes dimensões de partículas e macroporosidade (> 100 um) (observadas por SEM). Os grânulos e BCP1 tinha a mesma composição química, mas diferentes características físicas. Blocos tinham composições e topografias de superfície diferente. Para a porosidade, a um sistema de classificação semiquantitativa variando 3-1 asteriscos foi utilizado em alta a baixa porosidade, respectivamente

Cultura de células

As células estaminais mesenquimais humanas (MSC) foram isoladas a partir de medula óssea a partir de dadores macho inteiro, 18-30 anos de idade (Lonza, EUA), como relatado anteriormente (Briggs et al. 2009 ), e cultivadas em meios de controlo constituídos por Meio de Eagle Modificado por Dulbecco baixo teor de glucose (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (HyClone; Thermo Fisher Scientific, EUA) e 100 unidades / ml de antibiótico-antimicótico (Invitrogen). Células estaminais derivadas de tecido adiposo (ADSC; poiética adiposo humano-Derived Stem Cells) foram adquiridos a partir de Lonza (Walkersville, MD, EUA) e cultivadas em Meio de Crescimento ADSC (Bulletkit; Lonza). Células-tronco da polpa dental (dpsc) foram isoladas de terceiros molares extraídos no Departamento de Cirurgia Oral na New York University College of Dentistry (revisado e aprovado pelo Comitê de Ética), conforme relatado anteriormente (Kerkis et al. 2006 ). Resumidamente, após a extração, os dentes foram limpos com povidine e odontosecção foi realizada no nível cemento-esmalte usando uma rotação baixa viu sob irrigação profusão com solução salina. Após a exposição da câmara pulpar, tecido de celulose foi removido a partir da coroa e raízes, sob condições de esterilidade, e colocada em placas de Petri com meio DMEM / F12 (Gibco, Invitrogen) suplementado com 15% de FBS (HyClone®; Thermo Fisher Scientific), 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), 2 mM de L-glutamina (Gibco; Invitrogen) e 2 mM de ácidos aminados não essenciais (Gibco, Invitrogen). A polpa foi incubada a 37 ° C, 5% de CO ₂ , para separação de células estaminais a partir da matriz extracelular através de explante. As células foram caracterizadas em outra parte no que se refere às suas multipotency e marcadores de membrana celular e demonstrou ser células estaminais. Pré-osteoblastos humanos (MG-63; Lonza) foram cultivadas em alfa-MEM (Meio Mínimo Essencial alfa; Gibco, Invitrogen), suplementado com 10% de FBS (HyClone; Thermo Fisher Scientific) e 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina ( Sigma-Aldrich).

As células foram expandidas em meio de controlo (meio basal) até a passagem 3 e semeadas em andaimes BCP em 3 × 10 ⁴ células / cm ² em placas de polipropileno. As células em estruturas de suporte foram cultivadas em meios de controlo e osteogénicas (OS), composto por meios de controlo suplementados com 100 nM de dexametasona, 0,05 mM de ácido ascórbico e 10 mM de β-glicerofosfato. Como grupos de controlo, as células foram semeadas directamente em placas de cultura de tecidos de poliestireno (TCP) e cultivadas em ambos controlo (C) e meio osteoindutora (OS), sem andaimes. A fim de evitar eventuais influências sobre o crescimento celular, a viabilidade, a adesão e / ou diferenciação fornecida pelo meio de crescimento, o meio osteogénica foi usada nos respectivos grupos a partir da altura da sementeira de células (isto é, meios de controle não foi aplicado inicialmente e depois mudou a mídia OS). O meio foi trocado a cada 2-3 dias e as células foram mantidas numa atmosfera de 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C.

Microscopia eletrônica de varredura

As características físicas (presença de poros, as topografias da superfície) dos BCPs, bem como células estaminais e morfologias pré-osteoblásticas e aderência aos andaimes foram observados usando SEM (Hitachi S-3500 N LV-SEM, Singapura). As construções de células-tronco (sobre andaimes) foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas com solução de Karnovsky (fixador de Karnovsky, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EUA). As amostras foram então sujeitas a uma desidratação em série com 10, 30, 50, 70, 80, 90, e 100% de etanol, secou-se durante a noite com 1,1,2-triclorofluorethane e revestido a ouro.Bioceramics sem células-tronco foram diretamente revestida com ouro. Duas amostras de cada andaime foram analisados ​​e as construções foram avaliadas após 4 h, e 1, 7 e 14 dias de cultura.

A proliferação celular

O número de células foi quantificada usando quanti-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Molecular Probes, Invitrogen, EUA). Resumidamente, as células foram lisadas utilizando 0,1% de Triton X-100 durante 30 minutos e incubou-se à temperatura ambiente durante 5 min com o PicoGreen fluorocromo, que cora o ácido nucleico por ligação selectiva ao ADN de cadeia dupla. As placas foram lidas no leitor de microplacas FLX800 espectrofotómetro usando software KC Júnior no comprimento de onda de 480 nm e emissão a 520 nm correspondente. Foram estudadas amostras Fours por grupo por ponto de tempo; o ensaio foi repetido duas vezes e a análise foi realizada nos dias 4, 7, 11 e 14.

A viabilidade celular

A viabilidade celular foi quantificada utilizando o ensaio de XTT (XTT Viabilidade celular Assay Kit; Biotium, Hayward, CA, EUA), que mede a actividade das enzimas mitocondriais, de acordo com o protocolo do fabricante. A viabilidade celular foi determinada utilizando uma curva padrão de valores de absorvância para correlacionar padrões de números de células conhecidos. A absorvância foi medida com um espectrofotómetro num comprimento de onda de 450 nm. Estudaram-se quatro amostras de cada grupo, por ponto de tempo e os ensaios foram repetidos duas vezes. As amostras foram analisadas em 4, 11 e 14 dias de cultura.

qRT-PCR

O ARN total foi isolado utilizando Qiagen RNAeasy Kit (Qiagen, CA, EUA) e o ADN foi excluída usando ARNase Set Free DNase. Reacção em cadeia da polimerase-transcriptase reversa quantitativo (qRT-PCR) foi realizada usando uma etapa QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Primers específicos de oligonucleotídeos para sialoproteína óssea (sialoproteína integrina de ligação, IBSP; QT00093709); osteopontina (fosfoproteína segregada 1, SPP; QT01008798); RUNX2 (factor relacionado com a transcrição nanico 2; QT00020517); SOX9 (SRY [região sexo determinação Y] -Caixa 9; QT00001498); PPAR (PPAR; QT00029841); SOX2 (SRY-box 2; QT00237601) foram analisados ​​e a sua expressão genética relativa foi normalizada para a expressão relativa da RPLP0 gene de manutenção (P0 proteína ribossomal; QT01839887) ou GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato; QT01192646). As amostras foram analisadas nos dias 1, 3, 7 e / ou 14, analisadas em triplicado para cada ponto de tempo, e repetido duas vezes. A transcrição reversa foi realizada durante 30 min a 50 ° C, a activação de PCR durante 15 min a 95 ° C, e as reacções de amplificação foram realizadas através de 40 ciclos (15 s de desnaturação a 94 ° C, 30 s de recozimento a 55 ° C e 30 s de prolongamento a 72 ° C), utilizando o sistema de detecção MX4000 (Stratagene, EUA).

A actividade da fosfatase alcalina

A actividade da fosfatase alcalina foi medida utilizando o ensaio de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma-Aldrich, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. A absorvância foi medida a 405 nm usando um espectrofotómetro (Molecular Devices, EUA). Estudaram-se quatro amostras de cada grupo, por ponto de tempo e o ensaio foi repetido duas vezes. A actividade da fosfatase alcalina foi normalizado ao número de células, isto é, os dados da análise de proliferação (Quanti-iT PicoGreen dsDNA Ensaio). As análises foram realizadas nos dias 7, 11 e 14.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada através do teste de múltipla significação Bonferroni onde foram realizadas comparações para cada um e entre as variáveis ​​(pontos de tempo, meios de cultura de células, com e sem biomateriais e diferenças entre os biomateriais) ( p  <0,05).

Resultados

Todos os andaimes tinham superfícies nanoestruturadas com microporos semelhantes (<10 um), como observado por SEM. Os macroporos (> 100 um), bem como as topografias da superfície parecia variar entre os seis andaimes. Os macroporos foram observados em todos os andaimes, mas em menor grau, no grupo G60-80. Entre os blocos, o grupo BCP2 tinha superfície irregular e parecia ter mais macroporos (Figs.  2 e 3). As células foram observadas para aderir à superfície de todos os andaimes e para penetrar a sua estrutura porosa. As células estaminais a partir de vários tecidos e pré-osteoblastos tinha ligeiramente diferentes morfologias quando cultivadas directamente em placas de poliestireno (Fig.  4 ). Células-tronco de polpa dentária foram encontrados para estender múltiplas saliências filopodia-like dentro de horas após a semeadura, que lhes permitiram aderir às superfícies das bioceramics (Fig.  5 ). Em seguida, as células espalhadas sobre a superfície e dentro dos poros dos andaimes BCP (Fig.  4 ).

O número de células foi maior em grânulos, em comparação com blocos (Fig.  6 ). Quase todos os grupos apresentaram o maior número de células no dia 11 de cultura. As células cultivadas directamente em placas de poliestireno mostrando maior número em meios osteogénico, em comparação com os meios de controlo (p  <0,05). No entanto, as células cultivadas sobre o SBDC não mostraram diferenças estatisticamente significativas entre os dois meios de comunicação (controle e osteogênicas). O grupo G60-80 (grânulos com o tamanho de partícula menor, apresentando, por conseguinte, a área de superfície maior para a adesão de células) em meios de controlo mostraram o maior número de células no dia 11 ( p  <0,05) (Fig.  6a ). Entre os blocos, o número de células aumentou no grupo BCP2, embora não tenha sido estatisticamente significativa e foi inferior ao do grupo de controlo em meios osteogénico (MSC OS) (Fig.  6b ). Devido ao facto de que não se observaram diferenças significativas na proliferação de células entre os dias 7 e 11, e que os mais recentes (dia 11) apresentou o maior número de células em alguns grupos experimentais, dia 7, não foi incluído em mais ensaios. Os grupos G40-60 e BCP2 teve o maior número de células viáveis ​​entre todos os grupos biocerâmica e G40-60 foi equivalente ao grupo controle (Fig.  7 ).

A expressão de sialoproteina óssea (BSP) para células cultivadas em TCP (placa de cultura de tecido) e em grânulos em forma OS aumentou ao longo do tempo (Fig.  8a ). Interessantemente, as células cultivadas sobre BCP1 e BCP2 no meio de controlo tinha uma regulação positiva de BSP em comparação com meio OS ao dia 7. Esta expressão aumentada também foi observado para os grânulos de malha 20-40 (G20-40) e malha 40-60 (G40- 60) no dia 7 em meio de controlo, em comparação com OS médio ( p  <0,05). Expressão BSP diminuiu no grupo BCP3 em ambos os meios ao longo do tempo (Fig.  8b ). Foi detectado alto nível de BSP para os grânulos de 20-40 mesh em meios de controlo no dia 7 (Fig.  8 ).

A expressão de osteopontina (OPN) foi mais elevada para as células cultivadas sobre as biocerâmica (grânulos e blocos) em ambos os meios do que no TCP (grupos de controlo, isto é, MSC e MSC OS C) (Fig.  9 ). Exceção foi observada para as células em blocos BCP3 OS nos dias 7 e 14 e BCP2 OS no dia 14, que tiveram a expressão do gene equivalente OPN comparado ao grupo MSC OS. As células em grânulos G20-40 em meio controle apresentou a mais alta expressão do OPN no dia 7 entre todos os grupos (Fig.  9a). Dentro dos blocos, a regulação positiva de OPN foi observada para células cultivadas em BCP1 (dias 1, 7 e 14) e BCP2 (dia 7) em meio de controlo, em comparação com meio OS (Fig.  9b ).

Devido ao facto de o grupo G20-40 mostraram alta BSP e expressão do gene OPN no meio de controlo, que foi utilizado para a comparação de genes expressos nas fases iniciais da diferenciação de células estaminais a partir de origens diferentes, assim como pré-osteoblastos. MSC, ADSC e DPSC tinham perfis distintos de expressão de mRNA para RUNX2, SOX9 e PPARy quando cultivadas no TCP e no controle (C) mídia (Fig.  10a , 11a e 12a ).

MSC C (meio de controlo) em TCP tinha co-expressão predominante de RUNX2 e SOX9 e níveis muito baixos de PPARy, em todos os pontos de tempo (Fig.  10a ). OS MSC (meios osteogénico) sobre TCP aumentou a expressão de PPARy ao longo do tempo, com um pico no dia 14. Além disso, os níveis de RUNX-2 também aumentou de 1 a 14 dias, enquanto que foi simultaneamente regulada negativamente SOX9.SOX9 teve a maior expressão para MSC C em TCP no dia 14 (Fig.  10a ). MSC C em BCP (G20-40) significativamente os níveis de co-expressa RUNX2 e SOX9 ao longo do estudo, e muito baixos de PPARy foram detectados (Fig.  10b ). No dia 7, a expressão SOX9 para MSC em C BCP foi maior do que aqueles para os MSC C em TCP ( p  <0,05). Os níveis de RUNX2 e SOX9 para MSC C no BCP e no dia 3 de SOX9 no dia 7, nas mesmas condições, foram maiores do que aqueles para MSC OS no BCP (Fig.  10b ). MSC OS em BCP mostraram co-expressão acentuada de RUNX2 e SOX9 no dia 1, o que foi maior do que para todos os outros grupos no mesmo ponto de tempo. Por outro lado, os níveis de PPAR foram maiores no MSC OS no BCP, em comparação com MSC C no BCP (Fig.  10b ).

ADSC C em TCP expressa RUNX2 e SOX9 nos dias 1 e 3, quando PPAR não foi detectado. No entanto, nos dias 7 e 14, a expressão de PPARy foi significativamente aumentada para ADSC C (Fig.  11a ). ADSC OS em TCP expressa o PPARy em todos os pontos de tempo, de forma diferente a partir de ADSC C em TCP (Fig.  11 ). Estas células mostraram regulação positiva simultânea de RUNX2 e SOX9 no dia um em meio de OS, mas, nos pontos de tempo mais tardios, enquanto que SOX9 foi regulada negativamente a expressão de PPARy RUNX2 e manteve-se elevada (fig.  11b ). ADSC C em BCP mostrou a expressão simultânea de RUNX2, SOX9, PPARy e em todos os pontos no tempo, embora no dia 1, RUNX2 foi regulada positivamente de forma significativa (Fig.  11b ). Os níveis de PPARy foram menores para ADSC C BCP em comparação com as de todos os outros grupos; uma exceção foi observada no dia 1 de ADSC C no BCP, que expressa mais PPAR comparação com ADSC C em TCP. PPARy foi regulada negativamente de forma significativa para ADSC C em BCP em comparação com ADSC C em TCP, nos dias 3, 7 e 14. Por outro lado, ADSC OS em BCP mostraram um aumento da expressão de PPARy em comparação com ADSC C em BCP para todos os pontos temporais (Fig.  11b ). Estes valores foram, no entanto, inferiores aos praticados para ADSC OS em TCP. A expressão de RUNX2 e SOX9 foram semelhantes para ADSC C no BCP e para ADSC OS no BCP. No dia 1, RUNX2 para ADSC C no BCP foi maior do que para ADSC OS no BCP, embora esta diferença não foi estatisticamente significativa (Fig.  11 ).

No TCP, DPSC não expressou PPARy em C mídia, em qualquer ponto do tempo, mas RUNX2 e SOX9 co-expresso (Fig.  12a ). Ambos DPSC C em TCP e DPSC OS em TCP expressa principalmente RUNX2 e SOX9 (Fig.  12a ), exceto para DPSC OS no TCP, em que foram detectados casos de baixos níveis de PPAR no dia 7 (Fig.  12a ). Os níveis de ausência e muito baixos de PPAR observados com DPSC está em contraste com os níveis relativamente altos detectados por ADSC. A expressão do gene mais elevada foi mostrado por DPSC para RUNX2, no dia 7, em meios SO, em TCP. DPSC C e DPSC OS, tanto no BCP, expressa RUNX2 e SOX9 única (Fig.  12b ). Além disso, para DPSC em BCP, em ambos os meios C e OS, a expressão foi mais elevada do que SOX9 RUNX2 em todos os momentos, excepto no dia 14, quando DPSC OS em BCP apresentaram valores equivalentes de RUNX2 e SOX9 (Fig.  12b ). DPSC C no BCP suscitou maior expressão do que SOX9 DPSC OS no BCP nos dias 3, 7 e 14. Nos dias 3 e 7, SOX9 foi maior para DPSC C no BCP do que para DPSC OS no BCP (Fig.  12b ).

Pré-osteoblastos (MG-63) em C e OS meios de comunicação, em TCP, notavelmente SOX9 expressa em todos os pontos de tempo (Fig.  13a ). No dia 1, os níveis de RUNX2 e SOX9 para MG-63 OS no TCP foram equivalentes, mas, em momentos posteriores, SOX9 foi regulada, sendo significativamente maior do que RUNX2. Nenhuma expressão de sialoproteína óssea (BSP), um fabricante de osteogenic mais tarde, foi detectada pela MG-63 no TCP, em C e mídia OS (Fig  13a ). MG-63 C em BCP tinha uma expressão aumentada de RUNX2 nos dias 7 e 14 (Fig.  13b ). No dia 7, a expressão de SOX9 foi maior para MG-63 C no BCP do que para MG-63 OS no BCP (Fig.  13b ). Em media OS, MG-63 em BCP mostraram aumento co-expressão de RUNX2 e SOX9 no dia 14. Pré-osteoblastos comentou expressa BSP (sialoproteína osso) somente quando cultivadas em BCP, em ambos os meios, no dia 14. Aqui, a expressão BSP tende a ser maior em comparação com meios de C que em meios OS (Fig.  13b ).

A actividade de fosfatase alcalina (ALP) das MSCs na placa de poliestireno e nas seis PCN em meio OS aumentou ao longo do tempo e atingiram os valores mais elevados no dia 14 (Fig.  14 ). MSC semeadas em Bioceramics, grânulos e blocos, e em cultura de tecidos de poliestireno e cultivadas em meio de controlo não mostraram actividade de ALP (dados não mostrados). Células no BCP3 em meio OS teve a menor atividade e células ALP em BCP2 em meio OS apresentou a maior atividade entre todos os grupos no dia 14 (Fig.  14b ).

Discussão

Este estudo compara o efeito de seis andaimes de fosfato de cálcio bifásicos diferentes, divididas em dois grandes grupos, grânulos e blocos, na adesão, a viabilidade, proliferação e diferenciação osteogênica de CTM. É também compara a expressão de marcadores de diferenciação precoces de osteogénica de células estaminais isolado a partir de fontes distintas cultivadas numa forma granular do BCP. As células são cultivadas em dois meios de cultura diferentes, basal (controlo) e osteoindutor.

Além diferindo na forma física (grânulos de vários tamanhos contra blocos), o SBDC também diferiam na composição química. Variações em ambos os parâmetros químicos e físicos () têm sido relacionados com a criação de microambientes distintos, o que pode modular directamente as respostas de células como as células respondem a ambos intrínseca e extrínseca (microambiente hospedeiro) factores (Ohgushi e Caplan1999 ; Batouli et al., 2003 ; rochet et al. 2003 ; Knothe Tate et al., 2008 ; Lee et al. 2013 ).

Estruturas físicas dos biomateriais, incluindo a frequência, o tamanho e a forma dos poros, são resultado do processo de fabrico e demonstraram desempenhar um papel em várias fases da formação de novo osso, tais como a adesão celular e crescimento interno de tecido, depois de biomaterial implantação (Cheng et al.2010 ; Xia et al. 2014 ). Embora a porosidade não foi quantificado no presente estudo, estes materiais contidos em estruturas de poros tanto a micro e macro-escala. O aumento da porosidade leva a um aumento da área de superfície específica, a qual também influencia a solubilização de andaime (área de superfície aumentada favorece a solubilização / bioreabsorção) (Cheng et al. 2010 ). Por outro lado, a alta porosidade diminui geralmente propriedades mecânicas ‘biomateriais, independentemente da sua composição química (Lin et ai. 2007 ). Área superficial específica foi também correlacionada com o número de células: quanto maior for a área de superfície específica (que é o caso das superfícies BCP em comparação com as superfícies planas das placas de cultura de tecido), quanto maior o número de células ligadas (O’Brien et al.2005 ). “Andaimes de solubilização / bioreabsorção são uma função não só da estrutura física, mas também da composição química do andaime e cristalinidade. Biomateriais amorfos, tais como fosfatos de tricálcio, favor solubilização sobre os cristalinos, tais como LeGeros hidroxiapatitas ( 1993 ;. Lee et ai 2013 ).

Considerando macroporosidade favorece a colonização de células e tecidos crescimento interno, a microporosidade tem sido relacionada principalmente à capacidade do biomaterial para adsorver os fluidos biológicos (incluindo o aprisionamento de proteínas e outras moléculas exógenas ou aqueles apresentados no local da implantação cirúrgica) (Ripamonti 1996 ; Cheng et al. 2010 ; Schumacher et al., 2010 ; VERRON et ai. 2010 ;. Yuan et ai 2010 ). Tal adsorção de proteínas, que também é uma conseqüência da carga da superfície dos biomateriais e molhabilidade, foi considerado o maior fator principal responsável pela osteoindutividade intrínseca provocada por alguns, mas não todos os PCNs (Ripamonti 1996 ;. Cheng et al2010 ; Yuan et al . 2010 ). Considerando que os andaimes BCP analisados ​​aqui eram ricas em microporos, este pode ter sido um fator que contribui para a regulação positiva de osteopontina e sialoproteína osso, dois marcadores tardios de diferenciação osteogênica, observados com células cultivadas em meio controle. A superfície nanoestruturada pode também ter contribuído para tal resposta como já relatado na literatura (Li et al. 2012 ). Estes resultados sugeriram que o PCN pode ser apenas materiais osteoindutores e não osteocondução.

Aqui, a influência da forma de apresentação em resposta das células foi evidenciada principalmente pela comparação dos grânulos com o bloco BCP1. Grânulos gerais favoreceu a proliferação e diferenciação celular sobre blocos. Em meio de controlo, grânulos maiores promoveu a diferenciação das células, tal como observado por análises de expressão de genes, em comparação com as menores. Além disso, a presença de características físicas, especialmente micro e macroporos de um biomaterial pode melhorar substancialmente a viabilidade celular, proliferação e diferenciação, como observado com células em grupo BCP2. A importância da composição química foi enfatizada pela comparação de grupos BCP1 e BCP3.Biocerâmica fosfato de cálcio têm sido mostrados para enriquecer o microambiente através da libertação de iões de cálcio e de fosfato (Lin et ai. 2007 ; . Lee et al 2013 ; Shih et ai. 2014 ), fornecida por outro modo os níveis de cálcio nos meios de comunicação (Huang et al. 2007 ) e a adição de β-glicerofosfato (uma fonte de iões fosfato) nos meios de indução osteogénico (Beck et al. 2000 ). Um equilíbrio óptimo entre os iões de cálcio e fosfato no microambiente devem existir a fim de promover uma resposta de células favorável. No entanto, há evidências na literatura que demonstra que as concentrações dos iões libertados à base de fosfato de cálcio biomateriais-hidroxiapatita, composto de cálcio e hidroxiapatite, o metafosfato de colagénio-não interferem na adesão e proliferação de células estaminais derivadas de tecido adiposo e osteoblasto células (MC3T3) (Lee et al. 2013 ). Apesar disso, hidroxiapatitas ter provocado uma maior expressão de fosfatase alcalina de ARN-m de composto por colagénio e hidroxiapatite metafosfato de cálcio (Lee et al.2013 ).

A proliferação e diferenciação celular estão altamente coordenadas e inversamente correlacionado processos: quanto mais as células indiferenciadas, maior o seu potencial proliferativo (Zhu e Skoultchi 2001). Um aumento no número de células cultivadas em meios osteogénico alcançado no dia 11 pode indicar uma proliferação eficiente MSC antes da diferenciação osteogénica, o que ocorreu no dia 14. Tal acontecimento foi previamente relatada e relacionada com a fase proliferativa que é parte do osteogénico diferenciação (Huang et al. 2007 ). No nosso estudo, as células cultivadas em meios OS eram em menor número, em comparação com aqueles meios de controlo.

No presente estudo, a actividade da fosfatase alcalina permaneceu baixa nos grupos em que as células foram cultivadas em meio de controlo, com e sem biomateriais. Estes dados sugerem que os biocerâmica pode ter induzido a diferenciação osteogénica de MSCs (observada pela expressão do gene analisa), mas as células não podem ter progredido na maturação linhagem osteoblástica. Embora a medição de ALP foi utilizada para demonstrar a diferenciação osteogénica, este ensaio não devem ser considerados conclusivos (Weir e Xu 2010 ).

No entanto, para um biomaterial a ser osteoindutor, deve desencadear (nas primeiras fases de diferenciação) genes responsáveis ​​por dirigir o destino das células estaminais. Osteoindução, ou seja, o compromisso de células indiferenciadas e / ou imaturos em relação à linhagem de células osteoprogenitoras, representa o ponto de o processo altamente coordenada de osteogênese (Albrektsson e Johansson partida 2001 .; Baglio et al 2013 ). A fim de testar a capacidade osteoindutora do BCP, foi investigada a expressão de genes responsáveis ​​para a determinação do destino das células estaminais, em fases iniciais de diferenciação (RUNX2, SOX9, PPARy), de vários tipos de células. Portanto, as células-tronco isoladas de diferentes fontes (medula óssea, tecido adiposo e polpa dentária) e pré-osteoblastos (MG-63) foram cultivados no BCP que apresentou a maior expressão de BSP e OPN, ou seja, G20-40.

Os níveis e padrões de expressão do gene observada com as células estaminais cultivadas directamente em TCP e em meio C demonstraram que são inerentemente distinta. As variações no rendimento de células, a frequência de colónias, multipotency, taxa de proliferação, propriedades imunomoduladoras, secreção de citoquina, morfologia, imunofenotipagem, transcriptoma e do proteoma são algumas das diferenças que tenham sido anteriormente relatadas (Shi et al., 2001 ; Kern et al. 2006 ; Bochev et al. 2008 ; Peng et ai.2008 ; Rebelatto et al., 2008 ; Huang et al. 2009 ; Strioga et al., 2012 ; Hu et al., 2013 ; Jin et al., 2013 ;. Melief et al 2013 ).

Destino mesenquimais e osteochondrogenesis, para a formação óssea endocondral, são regulados por caminhos intrincados onde RUNX2 e SOX9 são os principais fatores de transcrição (Zou et al. 2006 ;. Grassel et al 2009 ; Cheng e Genever 2010 ). Ambos são co-expressos por células osteocondroprogenitoras precursoras que são encontrados no periósteo adulto e endósteo e no pericôndrio fetal, bem como em cartilagens secundárias inferiores, tais como no côndilo mandibular e cartilagem de Meckel (Leucht et al.,2008 ; Zhang et al. 2013 ).

RUNX2 (aka Osf2 / Cbfa1, Pepb2α1 ou AML3) é um regulador essencial do desenvolvimento do esqueleto, sendo observado nas condensações mesenquimais do esqueleto em desenvolvimento, e é o factor principal que controla a diferenciação dos osteoblastos e condrócitos maturação (Karsenty 1998 ; Lian et al. 2006 ; Zou et al., 2006 ; Komori 2010 ; Ding et al., 2012 ; Nishimura et al. 2012 ). RUNX2 integra vias de sinalização, tais como BMP / TGFbeta, Wnt, e Src (Lian et al. 2006 ), e activa os promotores de vários genes de proteínas do osso, tais como COL1A1 (Komori 2010 ). Por outro lado, SOX9 é conhecido por ser um gene marcador de fenótipo condrocítico além de jogar um papel central na organogénese de vários órgãos (Akiyama et al., 2002 ; Akiyama 2008 ; Nishimura et al., 2012 ;. Zhang et ai 2013 ). A co-expressão de RUNX2 e SOX9 se assemelha ao padrão de expressão de genes normalmente observada na formação óssea endocondral (Leucht et al., 2008 ; Cheng et al. 2010 ).

PPARy é o principal regulador da adipogênese (Lee et al. 2013 ). A sua supressão foi mostrada para aumentar os níveis de mRNA de BMP-2, RUNX2, osteocalcina e fosfatase alcalina de ADSC, aumentando assim a sua diferenciação osteogénica (Lee et al. 2013 ). A manutenção da expressão de PPARy por ADSC observado ao longo deste estudo sugere que a análise de longo prazo na formação de osso in vivo devem ser realizados para verificar a qualidade do osso recentemente formado e a sua capacidade para restabelecer o turn-over fisiológica do tecido ósseo. Por outro lado, ADSCs demonstraram ser mais promissor para reconstituir a hematopoiese de ratos irradiados que MSCs (Nakao et al. 2010 ).

DPSC expressa predominantemente RUNX2 e SOX9. No entanto, é importante notar que as partes de osteoblastos e de odontoblastos reguladores potentes e são semelhantes em termos de imunofenotipagem e a expressão das proteínas da matriz (Nakashima et al., 1994 ; Gronthos et al. 2000 ). No entanto, a aplicação de estratégias de DPSC para engenharia de tecido ósseo é questionado devido à evidência de que estas células gerar uma estrutura de dentina semelhantes in vivo em vez de osso lamelar tal como observado com MSC (Gronthos et al. 2000 ). Por outro lado, outros autores relataram a formação de osso maduro, utilizando células estaminais da polpa dentária isolados a partir de dentes de leite em vez de dentes permanentes (de Mendonça Costa et al. 2008 ).

Sialoproteina óssea (BSP) codifica uma fosfoproteína óssea matriz estrutural importante que apresenta uma sequência de ligação celular Arg-Gli-Asp (RGD) (Oldberg et al. 1988 ) e é conhecida por estar envolvida na nucleação de hidroxiapatite durante a mineralização óssea (Ogata 2008 ). O fato de que os pré-osteoblastos expressa apenas BSP quando cultivadas em andaimes BCP sugere que esses biomateriais pode promover a progressão da diferenciação de pré-osteoblastos em direção a uma fase mais madura do que células TCP.SOX2 é um importante factor de transcrição para a manutenção da capacidade de auto-renovação das células estaminais embrionárias, entre outras funções (Avilion et al., 2003 ; Luo et al. 2013 ). Foi utilizado como um controlo negativo neste estudo. SOX2 foi detectado em níveis muito baixos de MSCs, mas não para todos os outros tipos de células.

O significado deste estudo baseia-se na demonstração de que biocerâmica com qualquer composição química semelhante, mas as características físicas distintas ou vice-versa, induzir resposta diversa (proliferação versus a diferenciação) de células-tronco e que estes, quando isoladas a partir de vários tecidos, diferem na sua Perfil de expressão de genes em estágios iniciais de diferenciação osteogénica quando em contacto com o mesmo tipo de andaime (igual química e estrutura física). Estes dados podem ser tidos em conta para novas estratégias de engenharia de tecidos.

Conclusão

Este estudo concluiu que as células estaminais isoladas de várias origens são inerentemente diferentes e seu comportamento pode ser influenciado por andaimes BCP. Bioceramics, dependendo da sua composição química e as características físicas, ou pode favorecer a proliferação de células estaminais (grânulos pequenos) ou diferenciação (grânulos grandes). Blocos de biocerâmica que apresentam superfícies ásperas e um maior número de viabilidade micro e macroporosidade favor celular, proliferação e diferenciação sobre biomateriais com superfícies lisas e menor porosidade, mesmo que a sua composição química é considerado menos favorável para a osteogênese. A longo prazo, em estudos in vivo será necessário para determinar a qualidade do osso recentemente formado promovida por células estaminais a partir de diferentes fontes de tecido.

Agradecimentos

Os autores prestar homenagem ao falecido Dr. Racquel LeGeros, em cujo laboratório parte deste trabalho foi realizado; sua amizade, orientação e legado será lembrado para sempre. Este estudo foi apoiado por EINCO Biomaterial Ltda (Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil) e CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), Brasil.

Open AccessEste artigo é distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite a qualquer uso, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original (s) e da fonte são creditados.

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